Aparatura naukowa oraz stosowane techniki badawcze

Chromatografia cieczowa

Różnorodne odmiany chromatografii cieczowej to najczęściej wykorzystywane w naszym Zakładzie techniki badawcze. Biocząsteczki (najczęściej białka, peptydy, aminokwasy oraz pochodne witamin) rozdzielane są głównie technikami chromatografii podziałowej w układzie odwróconych faz, jonowymiennej, hydrofobowej, powinowactwa oraz filtracji żelowej, w odmianach niskociśnieniowej, średniociśnieniowej (FPLC) oraz wysokociśnieniowej (HPLC). Zakład posiada kilka zestawów chromatografów cieczowych niskociśnieniowych firm Pharmacia i BioRad (jeden w pokoju-chłodni), zestaw FPLC firmy Pharmacia oraz pięć zestawów HPLC (firm Dionex, Knauer, Shimadzu oraz Waters) z detektorami spektrofotometrycznymi i fluorescencyjnymi

Sekwencjonowanie białek i peptydów

Zakład Biochemii Analitycznej wyposażony jest w unikalny w Polsce automatyczny sekwenator białek i peptydów Procise 491 (Applied Biosystems). Aparat ten realizuje degradację Edmana łańcuchów polipeptydowych z chromatograficzną identyfikacją odszczepianych aminokwasów w postaci PTH pochodnych. Sekwenator jest niezwykle intensywnie wykorzystywany do różnorodnych badań białek oraz do charakterystyki nowych  peptydów bioaktywnych (w tym antybakteryjnych, hemolitycznych oraz bakteriocyn), plon publikacji przygotowanych przy udziale wyników z tego urządzenia liczy dziesiątki artykułów i szybko rośnie.

Techniki elektroforetyczne

Elektroforeza to druga najczęściej wykorzystywana w naszym Zakładzie technika analityczna. Białka i peptydy analizowane są na żelach poliakrylamidowych jedno i dwuwymiarowych (1D i 2D), zarówno w formacie mini jak i dużym. Przykładowo, porównawcza elektroforeza dwuwymiarowa jest stosowana do analizy wywołanych przez różne czynniki środowiskowe zmian zachodzących w proteomach wewnątrzkomórkowych i wydzielniczych mikroorganizmów. Pozwala na analizę różnic ekspresji białek produkowanych przez szczepy gronkowcowe, wykazujących i niewykazujących wirulencji. Wybrane białka identyfikowane są technikami spektrometrii masowej lub metodą bezpośredniego sekwencjonowania (degradacja Edmana).

Biologia molekularna

W Zakładzie Biochemii Analitycznej wykorzystywane są takie techniki biologii molekularnej jak: amplifikacje fragmentów kwasów nukleinowych, klonowanie, oznaczanie poziomu ekspresji genów, przygotowywanie konstruktów plazmidowych, wprowadzanie i wyłączanie genów. Prowadzona jest również produkcja białek rekombinowanych w Escherichia coli oraz bakteriach Gram-dodatnich (Bacillus subtilis, Staphylococcus sp.) oraz komórkach drożdżowych (Pichia pastoris). Techniki te wykorzystywane są do badania molekularnego podłoża wirulencji gronkowców, w tym biochemicznej i strukturalnej analizy białek zaangażowanych w wirulencję oraz do opracowywania systemów produkcji białek rekombinowanych dla celów laboratoryjnych i biotechnologicznych.

Spektrometria mas

Zakład dysponuje spektrometrem mas HCT Ultra (Bruker) ze źródłem jonów typu ESI i analizatorem w postaci pułapki jonowej. Aparat pozwala na jakościową analizę szerokiego spektrum związków biologicznie czynnych na podstawie precyzyjnego wyznaczania ich masy - bezpośrednio lub po wcześniejszej fragmentacji enzymatycznej. W laboratorium naszym spektrometr jest stosowany głównie do badań proteomicznych oraz do identyfikacji peptydów (np. badania nad bakteriocynami, nad peptydami antybakteryjnymi generowanymi z hemoglobiny czy nad kininopodobnymi peptydami powstającymi wskutek działania peptydaz drożdżowych).

Pomiary dynamicznego rozpraszania światła

Zakład posiada urządzenie do pomiarów dynamicznego rozproszenia światła (DLS), model DynaPro firmy Protein Solutions, które pozwala na bezpośrednią analizę rozmiarów cząsteczek białek w roztworze. Na podstawie wyznaczanego przez spektrometr DLS promienia hydrodynamicznego białka można wyliczyć jego masę cząsteczkową, określić jednorodność analizowanego preparatu (np. białka rekombinowanego) oraz śledzić procesy, którym towarzyszy zmiana rozmiarów cząsteczek białkowych, np. w wyniku dużych zmian konformacyjnych, agregacji bądź wiązania ligandów.